信帆生物推出：ELISA試劑盒HRP的制備方法

1).水提取：稱(chēng)取5kg用水沖刷干凈的鮮辣根(辣根皮中亦含有豐富的HRP)，用菜刀切成小碎塊，在絞肉機(jī)中絞碎1～2次。碎渣漿用1倍體積的水低溫下攪拌提取過(guò)一夜(亦可采用高速抽提法)。次日用甩干機(jī)(或離心機(jī))甩干，收集濾液，碎渣再用1/4倍體積水浸泡提取1次，合并2次濾液，測(cè)得總體積。

2).硫酸銨分級(jí)分離：在不斷攪拌下，每1000mL濾液中慢慢加入226g硫酸銨粉末(相當(dāng)于0.40飽和度，0℃)，大約在1~2h內(nèi)加完，置冷室中放置過(guò)一夜。次日將上清液小心地用虹吸管移出，下面混濁液以3 000r/min離心15min，棄沉淀，合并上清液。再按每1000mL上清液加258g硫酸銨粉末(0.8飽和度)隨加隨攪拌，當(dāng)硫酸銨全部溶解后，置冷室過(guò)一夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰凍離心機(jī)中以13000r/min離心20min，棄去上清液，收集沉淀。將沉淀懸浮于100~150mL蒸餾水中(加水量要使沉淀全部溶解為止)，分裝于透析袋內(nèi)，放在流動(dòng)自來(lái)水中進(jìn)行透析1～2天，直到硫酸銨透析完畢為止(可用5%乙酸鋇溶液或奈氏試劑進(jìn)行檢查)。然后改換成用蒸餾水透析，中間更換2~3次，用0.1mol/L硝酸銀溶液檢查透析外液無(wú)氯離子為止。將透析液合并，在冰凍離心機(jī)中以4 000r/min離心15min，棄去沉淀，量上清液的體積。

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3).丙酮分級(jí)分離：將上清液倒入燒杯并置冰鹽浴中，在不斷攪拌下，用細(xì)滴管沿杯壁加入1倍體積預(yù)冷至-15℃的丙酮，放置片刻，在冰凍離心機(jī)中以4000r/min離心15min，棄去沉淀。上清液再加入0.8體積(按原上清液體積)-15℃丙酮，(操作同上)，靜置后，在冰凍離心機(jī)中離心收集沉淀。將沉淀溶于少量蒸餾水中，透析除去丙酮。可得RZ值近于1的酶溶液。

4).精制：將上步酶液適當(dāng)稀釋?zhuān)渭?mol/L硫酸鋅溶液，使酶液中鋅離子濃度為10 -3 mol/L，5 000r/min離心10min，得上清液。再將沉淀用少量蒸餾水洗滌，離心，洗液與清液合并，分裝于透析袋內(nèi)，用水透析除鹽，用微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)行真空冰凍干燥(約得20mg)，產(chǎn)品呈米黃色纖維狀松軟物，HRP產(chǎn)品的RZ值可達(dá)3.0左右，置真空干燥器中低溫保存。

(1)戊二醛二步法)

1) 原理：戊二醛為一種雙功能試劑，通過(guò)其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價(jià)結(jié)合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物。

2)標(biāo)記步驟：

(1) 稱(chēng)取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室溫靜置過(guò)一夜。

(2) 反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/1分鐘，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。

(3) 將待標(biāo)記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。

(4) 用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3?小時(shí)。)

(5) 加0.2M賴(lài)氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時(shí)。

(6) 在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時(shí)。

(7) 3000rpm離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，zui后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。

(8) 將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測(cè))，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。

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