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乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）試劑盒

測(cè)定意義：

LDH（EC 1.1.1.27）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是糖酵解途徑的末端酶，催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應(yīng)，伴隨著NAD⁺/NADH之間互變。

測(cè)定原理：

LDH催化NAD⁺氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步與2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度成正比。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：30mL×1瓶， 4℃保存；

試劑一：液體15 mL×1瓶， 4℃保存；

試劑二：粉劑×1支，-20℃保存，用時(shí)加入1.3 mL雙蒸水充分溶解備用，配好后-20 ℃保存，可保存兩周，禁止反復(fù)凍融；

試劑三：液體15 mL×1瓶，4℃保存；

試劑四：液體50 mL×1瓶L，4℃保存；

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：

1、 細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備 ：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，棄上清，按照每200萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入400μL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20％，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次）。8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液或者生理鹽水進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作表（在1mL EP管中反應(yīng)）：

充分混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴15min

充分混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴15min

充分混勻，室溫靜置3分鐘，450 nm下測(cè)定吸光度

注意事項(xiàng)：

1、粗酶液的提取必須在0℃ - 4℃中操做完成，以防止酶變性失活。測(cè)定過(guò)程中樣本﹑試劑二和標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液必須在冰上放置。

3、由于每個(gè)樣本都要做測(cè)定管和對(duì)照管，因此本試劑盒50管可測(cè)24個(gè)樣本。

LDH活力單位的計(jì)算：

1、血清（漿）LDH活力的計(jì)算

單位的定義：每升血清（漿）與基質(zhì)作用15分鐘，在反應(yīng)體系中生成1 μmol的丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

LDH（U/L）=1379×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）

2、組織中LDH活力的計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白與基質(zhì)作用15分鐘，在反應(yīng)體系中生成1 nmol的丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

LDH（U/mg prot）=1379×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷蛋白濃度（mg/mL）

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織與基質(zhì)作用15分鐘，在反應(yīng)體系中生成1 nmol的丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

LDH（U/g 鮮重）=1379×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷樣本鮮重（g/mL）

3、細(xì)菌或細(xì)胞中LDH活力的計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白與基質(zhì)作用15分鐘，在反應(yīng)體系中生成1 nmol的丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

LDH（U/mg prot）=1379×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷蛋白濃度（mg/mL）

（2）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞與基質(zhì)作用15分鐘，在反應(yīng)體系中生成1 nmol的丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

LDH（U/10⁴ cell）=1379×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷細(xì)菌或細(xì)胞密度（10⁴ cell /mL）