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樣本勻漿方式知多少,信帆生物為您解答

更新時間:2016-10-28      瀏覽次數(shù):1703

樣本勻漿方式知多少,信帆生物為您解答!

勻漿的方式:手工勻漿,超聲破碎,裂解液裂解,反復(fù)凍融。

① 手工勻漿:在細(xì)胞沉淀中加入一定量的PBS(PBS的加入量根據(jù)所測指標(biāo)的不同而有所改變,一般加入0.5ml,細(xì)胞密度不小于一百萬個/ml),混勻,將細(xì)胞懸浮于PBS中,用移液器將細(xì)胞懸浮液移至玻璃勻漿管中(2ml玻璃勻漿管),將玻璃勻漿管置于冰水混合物中,手動勻漿3分鐘,然后取破碎好的細(xì)胞懸浮液進行測定。

② 超聲破碎:

在細(xì)胞沉淀中加入一定量的PBS(PBS的加入量根據(jù)所測指標(biāo)的不同而有所改變,一般加入0.5ml,細(xì)胞密度不小于一百萬個/ml),混勻,將細(xì)胞懸浮于PBS中,在冰水浴條件下進行如下操作:

a、用超聲粉碎機進行粉碎,可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細(xì)胞破碎,也可用國產(chǎn)超聲波發(fā)生儀,用400安培,5秒/次,間隙10秒反復(fù)3~5次。

b、用超聲細(xì)胞破碎儀,300W功率,每次超聲3~5秒,間隔30秒,重復(fù)4~5次。

③ 裂解液裂解 

常用裂解液有SDSNP-40、TritonX-100,這三種去垢劑的作用是不同的,或者說作用力量強弱不同。

1、SDS屬于離子型去垢劑,zui厲害,基本可以把細(xì)胞*破掉,DNA會釋放出來,裂解液變得很粘稠。

2、NP-40是很溫和的去垢劑,1%濃度的基本可以破壞掉胞膜,而對核膜破壞的作用弱,結(jié)合特定的buffer可以獲得胞漿蛋白。

3、TritonX-100的能力介于NP40和SDS之間,偏向于NP40,也是常用的細(xì)胞裂解液成分之一,在保護蛋白活性方面有一定作用(SDS基本會使蛋白變性失活)。

去垢劑屬性只是一方面,buffer、配比、濃度、提取方法和材料處理也都是關(guān)鍵因素

由于很多裂解液都是蛋白變性劑,對酶活力的測定有一定的影響,一般不推薦用裂解液進行裂解。

④ 反復(fù)凍融:

在細(xì)胞沉淀中加入一定量的PBS(PBS的加入量根據(jù)所測指標(biāo)的不同而有所改變,一般加入0.5ml,細(xì)胞密度不小于一百萬個/ml),混勻,將細(xì)胞懸浮于PBS中,放低溫冰箱中結(jié)冰,溶解,再結(jié)冰,再溶解,反復(fù)3次左右)。

由于反復(fù)凍融對酶活力影響較大,一般不推薦使用

 

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